Όλα σχετικά με τα ένζυμα περιορισμού

Οι ενδονουκλεάσες περιορισμού είναι μία κατηγορία ενζύμου που κόβει μόρια ϋΝΑ. Κάθε ένζυμο αναγνωρίζει μοναδικές αλληλουχίες νουκλεοτιδίων σε έναν κλώνο DNA - συνήθως περίπου τέσσερα έως έξι ζεύγη βάσεων. Οι αλληλουχίες είναι παλινδρομικές κατά το ότι ο συμπληρωματικός κλώνος DNA έχει την ίδια αλληλουχία στην αντίστροφη κατεύθυνση. Με άλλα λόγια, και οι δύο κλώνοι του DNA κόβονται στην ίδια θέση.

Πού βρίσκονται αυτά τα ένζυμα

Τα ένζυμα περιορισμού βρίσκονται σε πολλά διαφορετικά στελέχη βακτηριδίων όπου ο βιολογικός τους ρόλος είναι να συμμετέχουν στην κυτταρική άμυνα. Αυτά τα ένζυμα περιορίζουν το ξένο (ιογενές) ϋΝΑ που εισέρχεται στα κύτταρα καταστρέφοντάς τα. Τα κύτταρα-ξενιστές έχουν ένα σύστημα τροποποίησης-περιορισμού που μεθυλιώνει το δικό τους DNA σε θέσεις ειδικές για τα αντίστοιχα ένζυμα περιορισμού τους, προστατεύοντας έτσι από τη διάσπαση. Έχουν ανακαλυφθεί περισσότερα από 800 γνωστά ένζυμα που αναγνωρίζουν περισσότερες από 100 διαφορετικές αλληλουχίες νουκλεοτιδίων.

Τύποι περιοριστικών ενζύμων

Υπάρχουν πέντε διαφορετικοί τύποι περιοριστικών ενζύμων. Ο τύπος Ι κόβει το DNA σε τυχαίες θέσεις έως και 1.000 ή περισσότερα ζεύγη βάσεων από τη θέση αναγνώρισης. Ο τύπος III κόβεται σε περίπου 25 ζεύγη βάσεων από τη θέση. Και οι δύο αυτοί τύποι απαιτούν ΑΤΡ και μπορεί να είναι μεγάλα ένζυμα με πολλαπλές υπομονάδες. Τα ένζυμα τύπου II, τα οποία χρησιμοποιούνται κυρίως στη βιοτεχνολογία, κόβουν το DNA εντός της αναγνωρισμένης αλληλουχίας χωρίς την ανάγκη για ΑΤΡ και είναι μικρότερα και απλούστερα.

Τα ένζυμα περιορισμού τύπου II ονομάζονται σύμφωνα με το βακτηριακό είδος από το οποίο απομονώνονται. Για παράδειγμα, το ένζυμο EcoRI απομονώθηκε από Ε. Coli. Το μεγαλύτερο μέρος του κοινού είναι εξοικειωμένο με τα κρούσματα Ε. Coli στα τρόφιμα.

Τα ένζυμα περιορισμού Τύπου II μπορούν να παράγουν δύο διαφορετικούς τύπους κομματιών ανάλογα με το αν κόβουν και τους δύο κλώνους στο κέντρο της αλληλουχίας αναγνώρισης ή κάθε κλώνο πιο κοντά στο ένα άκρο της αλληλουχίας αναγνώρισης.

Η προηγούμενη περικοπή θα δημιουργήσει "αμβλύ άκρα" χωρίς προεξοχές νουκλεοτιδίων. Το τελευταίο δημιουργεί "κολλώδη" ή "συνεκτικά" άκρα επειδή κάθε προκύπτον θραύσμα DNA έχει μια προεξοχή που συμπληρώνει τα άλλα θραύσματα. Και οι δύο είναι χρήσιμες στη μοριακή γενετική για την παραγωγή ανασυνδυασμένου DNA και πρωτεϊνών. Αυτή η μορφή DNA ξεχωρίζει γιατί παράγεται από την σύνδεση (συγκόλληση) δύο ή περισσοτέρων διαφορετικών κλώνων που δεν ήταν αρχικά συνδεδεμένα μεταξύ τους.

Τα ένζυμα τύπου IV αναγνωρίζουν το μεθυλιωμένο ϋΝΑ και τα ένζυμα τύπου V χρησιμοποιούν RNAs για την αποκοπή αλληλουχιών σε εισβάλλοντες οργανισμούς που δεν είναι παλίνδρομοι.

Χρήση στη βιοτεχνολογία

Τα ένζυμα περιορισμού χρησιμοποιούνται στη βιοτεχνολογία για να κόψουν το DNA σε μικρότερους κλώνους προκειμένου να μελετήσουν τις διαφορές μήκους θραυσμάτων μεταξύ των ατόμων. Αυτό αναφέρεται ως πολυμορφισμός μήκους θραυσμάτων περιορισμού (RFLP). Χρησιμοποιούνται επίσης για κλωνοποίηση γονιδίων.

Οι τεχνικές RFLP έχουν χρησιμοποιηθεί για να προσδιορίσουν ότι άτομα ή ομάδες ατόμων έχουν διακριτικές διαφορές στις αλληλουχίες γονιδίων και πρότυπα διάσπασης περιορισμού σε ορισμένες περιοχές του γονιδιώματος. Η γνώση αυτών των μοναδικών περιοχών είναι η βάση για την αποτύπωση δακτυλικών αποτυπωμάτων DNA. Κάθε μια από αυτές τις μεθόδους εξαρτάται από τη χρήση ηλεκτροφόρησης πηκτής αγαρόζης για διαχωρισμό των θραυσμάτων ϋΝΑ. Το ρυθμιστικό διάλυμα TBE, το οποίο αποτελείται από βάση Tris, βορικό οξύ και EDTA, χρησιμοποιείται συνήθως για ηλεκτροφόρηση πηκτής αγαρόζης για την εξέταση προϊόντων ϋΝΑ.

Χρήση στην κλωνοποίηση

Η κλωνοποίηση συχνά απαιτεί την εισαγωγή ενός γονιδίου σε ένα πλασμίδιο, το οποίο είναι ένας τύπος ενός τεμαχίου DNA. Τα ένζυμα περιορισμού μπορούν να βοηθήσουν στη διαδικασία λόγω των μονόκλωνων προεξοχών που αφήνουν όταν κάνουν κοψίματα. Η ϋΝΑ λιγάση, ένα ξεχωριστό ένζυμο, μπορεί να ενώσει μαζί δύο μόρια ϋΝΑ με τα αντίστοιχα άκρα.

Έτσι, χρησιμοποιώντας ένζυμα περιορισμού με ένζυμα λιγάσης ϋΝΑ, κομμάτια DNA από διαφορετικές πηγές μπορούν να χρησιμοποιηθούν για να δημιουργήσουν ένα μόριο ϋΝΑ.