Πώς να κάνετε το TBE Buffer σε 3 εύκολα βήματα

Το ρυθμιστικό διάλυμα TBE είναι ένα ρυθμιστικό διάλυμα που αποτελείται από βάση Tris, βορικό οξύ και EDTA (ή Tris-borate-EDTA συνολικά). Αυτό το ρυθμιστικό διάλυμα χρησιμοποιείται συχνά για ηλεκτροφόρηση πηκτής αγαρόζης στην ανάλυση προϊόντων ϋΝΑ που προκύπτει από ενίσχυση PCR, πρωτόκολλα καθαρισμού ϋΝΑ ή πειράματα κλωνοποίησης ϋΝΑ.

Το ρυθμιστικό διάλυμα ΤΒΕ είναι ιδιαίτερα χρήσιμο για τον διαχωρισμό μικρότερων θραυσμάτων ϋΝΑ (ΜΒ <1000), όπως μικρά προϊόντα χωνεύσεως ενζύμων περιορισμού. Το TBE έχει μεγαλύτερη ικανότητα αποθήκευσης και θα δώσει μεγαλύτερη ευκρίνεια από την προσωρινή μνήμη TAE. Το ρυθμιστικό διάλυμα ΤΑΕ είναι διάλυμα που αποτελείται από βάση Tris, οξικό οξύ και EDTA (Tris-acetate-EDTA).

Η ΤΒΕ είναι γενικά ακριβότερη από την ΤΑΕ και αναστέλλει την λιγάση του ϋΝΑ, η οποία μπορεί να προκαλέσει προβλήματα εάν επιδιωχθούν μεταγενέστερα βήματα καθαρισμού και σύνδεσης DNA. Με τα τρία απλά βήματα που ακολουθούν, μάθετε πώς να κάνετε TBE buffer. Δεν θα πρέπει να διαρκέσει περισσότερο από περίπου 30 λεπτά για να δημιουργήσετε αυτό το buffer. Δείτε πώς:

Απόθεμα διαλύματος EDTA

Θα πρέπει να προετοιμαστεί ένα διάλυμα EDTA (αιθυλενοδιαμινο τετραοξικό οξύ) μπροστά από το χρόνο. Το EDTA δεν θα φτάσει τελείως σε διάλυμα έως ότου το ρΗ ρυθμιστεί σε περίπου 8,0. Για ένα αποθεματικό διάλυμα 500 χιλιοστόλιτρων EDTA 0,5 Μ, ζυγίστε 93,05 γραμμάρια δινατρίου άλατος EDTA (FW = 372,2). Στη συνέχεια διαλύεται σε 400 χιλιοστόλιτρα απιονισμένου νερού και ρυθμίζεται το pH με NaOH. Στη συνέχεια, συμπληρώστε το διάλυμα σε τελικό όγκο 500 χιλιοστόλιτρων.

Απόθεμα διαλύματος ΤΒΕ

Δημιουργήστε ένα συγκεντρωμένο (5χ) αποθεματικό διάλυμα ΤΒΕ ζυγίζοντας 54 g Tris βάσης (FW = 121.14) και 27.5 g βορικού οξέος (FW = 61.83) και διαλύοντας και τα δύο σε περίπου 900 ml απιονισμένου νερού. Στη συνέχεια προστίθενται 20 χιλιοστόλιτρα EDTA 0,5 Μ (ρΗ 8,0) και ρυθμίζεται το διάλυμα σε τελικό όγκο 1 λίτρου. Το διάλυμα αυτό μπορεί να αποθηκευτεί σε θερμοκρασία δωματίου, αλλά θα σχηματιστεί ένα ίζημα σε παλαιότερα διαλύματα. Αποθηκεύστε το ρυθμιστικό σε γυάλινες φιάλες και απορρίψτε αν έχει σχηματιστεί ένα ίζημα.

Λύση εργασίας της TBE

Για ηλεκτροφόρηση πηκτής αγαρόζης, μπορεί να χρησιμοποιηθεί ρυθμιστικό διάλυμα ΤΒΕ σε συγκέντρωση 0,5χ (αραίωση 1:10 του συμπυκνωμένου αποθέματος). Αραιώστε το διάλυμα αποθέματος κατά 10 φορές σε απιονισμένο νερό. Οι τελικές συγκεντρώσεις διαλυμάτων είναι 45 mM Tris-βορικό και 1 mM EDTA. Το ρυθμιστικό είναι τώρα έτοιμο για χρήση κατά τη λειτουργία ενός πηκτώματος αγαρόζης.

Ο, τι χρειάζεσαι

Για να δημιουργήσετε προσωρινή μνήμη TBE, θα χρειαστείτε μόνο τέσσερις ουσίες. Τα υπόλοιπα στοιχεία αυτής της λίστας είναι εξοπλισμός. Οι τέσσερις απαιτούμενες ουσίες είναι το δινάτριο άλας EDTA, η βάση Tris, το βορικό οξύ και το απιονισμένο νερό.

Όσον αφορά τον εξοπλισμό, θα χρειαστείτε ένα μετρητή ρΗ και πρότυπα βαθμονόμησης, ανάλογα με την περίπτωση. Εκτός από αυτό, θα χρειαστείτε δοχεία ή φιαλίδια 600 ml και 1500 ml. Η στρογγυλοποίηση των αναγκών του εξοπλισμού σας είναι κλιμακωτές φιάλες και αναδευτήρες και ανακατεύετε πλάκες.

Ελέγξτε το απόθεμα στο εργαστήριο που θα χρησιμοποιήσετε για να βεβαιωθείτε ότι έχετε όλα όσα χρειάζεστε για να ξεκινήσετε. Τίποτα δεν είναι χειρότερο από το να χρειαστεί να σταματήσετε στη μέση της προετοιμασίας μιας λύσης επειδή έχετε εξαντλήσει τα κατάλληλα υλικά. Εάν το εργαστήρι σας βρίσκεται στο σχολείο ή στον εργασιακό σας χώρο, ελέγξτε με το κατάλληλο προσωπικό για να δείτε ότι έχουν όλα τα στοιχεία στο απόθεμα. Κάτι τέτοιο μπορεί να σας εξοικονομήσει χρόνο και ενέργεια στο τέλος.