Ενίσχυση DNA μέσω αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης

PCR σημαίνει αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης, μία τεχνική μοριακής βιολογίας για την ενίσχυση τμημάτων του DNA, δημιουργώντας πολλαπλά αντίγραφα χρησιμοποιώντας ένζυμα DNA πολυμεράσης υπό ελεγχόμενες συνθήκες. Τόσο λίγο όσο ένα μόνο αντίγραφο ενός τμήματος DNA ή ενός γονιδίου μπορεί να κλωνοποιηθεί σε εκατομμύρια αντίγραφα, επιτρέποντας την ανίχνευση χρησιμοποιώντας χρωστικές και άλλες τεχνικές απεικόνισης.

Αναπτύχθηκε το 1983, η διαδικασία της PCR κατέστησε δυνατή την εκτέλεση αλληλουχίας DNA και την αναγνώριση της σειράς των νουκλεοτιδίων σε μεμονωμένα γονίδια. Η μέθοδος χρησιμοποιεί θερμική κυκλοποίηση ή επαναλαμβανόμενη θέρμανση και ψύξη της αντίδρασης για τήξη και αναδιπλασιασμό ϋΝΑ. Καθώς συνεχίζεται η PCR, το "νέο" ϋΝΑ χρησιμοποιείται ως εκμαγείο για αντιγραφή και ακολουθεί αλυσιδωτή αντίδραση, ενισχύοντας εκθετικά το πρότυπο ϋΝΑ.

Οι τεχνικές PCR εφαρμόζονται σε πολλούς τομείς της βιοτεχνολογίας, όπως η μηχανική πρωτεΐνης, η κλωνοποίηση, η εγκληματολογία (αποτύπωση δακτυλικών αποτυπωμάτων DNA), η εξέταση πατρότητας, η διάγνωση κληρονομικών και / ή μολυσματικών ασθενειών και η ανάλυση περιβαλλοντικών δειγμάτων.

Στην ιατροδικαστική, ειδικότερα, η PCR είναι ιδιαίτερα χρήσιμη επειδή ενισχύει ακόμη και τη μικρότερη ποσότητα αποδεικτικών στοιχείων DNA. Η PCR μπορεί επίσης να χρησιμοποιηθεί για να αναλύσει DNA που είναι χιλιάδες ετών και αυτές οι τεχνικές έχουν χρησιμοποιηθεί για να ταυτοποιήσουν τα πάντα από έναν μαμούθ 800.000 ετών σε μούμιες από όλο τον κόσμο.

Η διαδικασία PCR έχει ως εξής:

• Αρχικοποίηση: Αυτό το βήμα είναι απαραίτητο μόνο για ϋΝΑ πολυμεράσες που απαιτούν PCR θερμής έναρξης. Η αντίδραση θερμαίνεται μεταξύ 94 και 96 ° C και διατηρείται για 1-9 λεπτά.
• Μετουσίωση: Εάν η διαδικασία δεν απαιτεί προετοιμασία, η μετουσίωση είναι το πρώτο βήμα. Η αντίδραση θερμαίνεται στους 94-98 ° C για 20-30 δευτερόλεπτα. Οι δεσμοί υδρογόνου του εκμαγείου ϋΝΑ διασπάται και δημιουργούνται μονοκλωνικά μόρια ϋΝΑ.
• Ξεπύρωμα: Η θερμοκρασία αντίδρασης είναι χαμηλότερη μεταξύ 50 και 65 ° C και διατηρείται για 20-40 δευτερόλεπτα. Οι εκκινητές ανασυνδέονται με το μονόκλωνο DNA πρότυπο. Η θερμοκρασία είναι εξαιρετικά σημαντική κατά τη διάρκεια αυτού του βήματος. Εάν είναι πολύ ζεστό, το αστάρι μπορεί να μην δεσμεύεται. Εάν είναι πολύ κρύο, το αστάρι μπορεί να δεσμεύει ατελείωτα. Ένας καλός δεσμός σχηματίζεται όταν η αλληλουχία εκκινητή ταιριάζει απόλυτα με την αλληλουχία προτύπου.

• Επέκταση / επιμήκυνση: Η θερμοκρασία κατά τη διάρκεια αυτού του σταδίου ποικίλει ανάλογα με τον τύπο της πολυμεράσης. Η ϋΝΑ πολυμεράση συνθέτει έναν εντελώς νέο κλάδο ϋΝΑ.
• Τελική επιμήκυνση: Αυτό το βήμα πραγματοποιείται στους 70-74 ° C για 5-15 λεπτά μετά τον τελικό κύκλο PCR.
• Τελική αναμονή: Αυτό το βήμα είναι προαιρετικό. Η θερμοκρασία διατηρείται στους 4-15 ° C και κατακρημνίζεται η αντίδραση.

Η διαδικασία χωρίζεται σε τρία στάδια:

• Εκθετική ενίσχυση: Κατά τη διάρκεια κάθε κύκλου, το προϊόν (το συγκεκριμένο κομμάτι του DNA που αντιγράφεται) διπλασιάζεται.
• Στάδιο ισοστάθμισης: Καθώς η ϋΝΑ πολυμεράση χάνει δραστικότητα και καταναλώνει αντιδραστήρια, η αντίδραση επιβραδύνεται.
• Οροπέδιο: Δεν συσσωρεύεται πλέον προϊόν.