Πώς λειτουργεί η αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης για την ενίσχυση των γονιδίων

Η αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR) είναι μια μοριακή γενετική τεχνική για την παραγωγή πολλαπλών αντιγράφων ενός γονιδίου και είναι επίσης μέρος της διεργασίας γονιδιακής ακολουθίας.

Πώς λειτουργεί η αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης

Τα γονιδιακά αντίγραφα κατασκευάζονται με τη χρήση δείγματος DNA και η τεχνολογία είναι αρκετά καλή ώστε να παράγουν πολλαπλά αντίγραφα από ένα μόνο αντίγραφο του γονιδίου που βρέθηκε στο δείγμα. Η PCR ενίσχυση ενός γονιδίου για την παραγωγή εκατομμυρίων αντιγράφων επιτρέπει την ανίχνευση και ταυτοποίηση αλληλουχιών γονιδίων με οπτικές τεχνικές που βασίζονται στο μέγεθος και το φορτίο (+ ή -) του τεμαχίου του DNA.

Υπό ελεγχόμενες συνθήκες, μικρά τμήματα ϋΝΑ παράγονται από ένζυμα γνωστά ως ϋΝΑ πολυμεράσες, που προσθέτουν συμπληρωματικά δεοξυνουκλεοτίδια (dNTPs) σε ένα τεμάχιο ϋΝΑ γνωστό ως «πρότυπο». Ακόμη μικρότερα κομμάτια DNA, που ονομάζονται "εκκινητές" χρησιμοποιούνται ως σημείο εκκίνησης για την πολυμεράση.

Οι εκκινητές είναι μικρά ανθρωπογενή κομμάτια DNA (ολιγομερή), συνήθως μεταξύ 15 και 30 νουκλεοτιδίων. Αυτά γίνονται με τη γνώση ή την εικασία των βραχέων αλληλουχιών DNA στα ίδια τα άκρα του γονιδίου που ενισχύεται. Κατά τη διάρκεια της PCR, το DNA που έχει υποβληθεί σε προσδιορισμό αλληλουχίας θερμαίνεται και οι διπλοί κλώνοι διαχωρίζονται. Κατά την ψύξη, τα αστάρια δεσμεύονται στο πρότυπο (που ονομάζεται ανόπτηση) και δημιουργούν ένα σημείο για να αρχίσει η πολυμεράση.

Η τεχνική PCR

Η αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR) κατέστη δυνατή με την ανακάλυψη θερμοφιλίων και θερμόφιλων ενζύμων πολυμεράσης (ένζυμα που διατηρούν δομική ακεραιότητα και λειτουργικότητα μετά από θέρμανση σε υψηλές θερμοκρασίες). Τα βήματα που εμπλέκονται στην τεχνική PCR είναι τα εξής:

• Δημιουργείται μίγμα, με βελτιστοποιημένες συγκεντρώσεις του προτύπου DNA, ένζυμο πολυμεράσης, εκκινητές και dNTPs. Η δυνατότητα θερμάνσεως του μίγματος χωρίς μετουσίωση του ενζύμου επιτρέπει τη μετουσίωση της διπλής έλικας του δείγματος ϋΝΑ σε θερμοκρασίες στην κλίμακα των 94 βαθμών Κελσίου.
• Μετά την μετουσίωση, το δείγμα ψύχεται σε ένα πιο μέτριο εύρος, περίπου 54 μοίρες, το οποίο διευκολύνει την ανόπτηση (δέσμευση) των εναρκτήρων στα μονόκλωνα προπλάσματα ϋΝΑ.
• Στο τρίτο βήμα του κύκλου, το δείγμα επαναθερμαίνεται στους 72 βαθμούς, η ιδανική θερμοκρασία για πολυμεράση DNA Taq, για επιμήκυνση. Κατά τη διάρκεια της επιμήκυνσης, η ϋΝΑ πολυμεράση χρησιμοποιεί τον αρχικό μοναδικό κλώνο του ϋΝΑ ως εκμαγείο για να προσθέσει συμπληρωματικά dNTPs στα 3 'άκρα του κάθε εκκινητή και να δημιουργήσει ένα τμήμα δίκλωνου ϋΝΑ στην περιοχή του γονιδίου ενδιαφέροντος.

• Οι εκκινητές που έχουν αναδιαρθρωθεί σε αλληλουχίες ϋΝΑ που δεν είναι ακριβείς αντιστοιχούν δεν παραμένουν ανηγμένες σε 72 μοίρες, περιορίζοντας έτσι την επιμήκυνση στο γονίδιο που μας ενδιαφέρει.

Αυτή η διαδικασία μετουσίωσης, ανόπτησης και επιμήκυνσης επαναλαμβάνονται πολλαπλές (30-40) φορές, αυξάνοντας έτσι εκθετικά τον αριθμό των αντιγράφων του επιθυμητού γονιδίου στο μείγμα. Αν και αυτή η διαδικασία θα ήταν αρκετά κουραστική εάν εκτελέστηκε με το χέρι, δείγματα μπορούν να παρασκευαστούν και να επωαστούν σε ένα προγραμματιζόμενο Thermocycler, πλέον συνηθισμένο στα περισσότερα μοριακά εργαστήρια, και μια πλήρη αντίδραση PCR μπορεί να πραγματοποιηθεί σε 3-4 ώρες.

Κάθε βαθμίδα μετουσίωσης σταματά τη διαδικασία επιμήκυνσης του προηγούμενου κύκλου, κόβοντας έτσι τον νέο κλώνο του DNA και διατηρώντας τον περίπου στο μέγεθος του επιθυμητού γονιδίου. Η διάρκεια του κύκλου επιμήκυνσης μπορεί να γίνει μεγαλύτερη ή μικρότερη ανάλογα με το μέγεθος του ενδιαφέροντος γονιδίου, αλλά τελικά, μέσω επαναλαμβανόμενων κύκλων PCR, η πλειονότητα των υποδειγμάτων θα περιοριστεί στο μέγεθος του ενδιαφέροντος γονιδίου μόνο, καθώς θα έχουν παραχθεί από προϊόντα και των δύο εκκινητών.

Υπάρχουν διάφοροι διαφορετικοί παράγοντες για την επιτυχή PCR που μπορούν να χρησιμοποιηθούν για την ενίσχυση των αποτελεσμάτων. Η πιο ευρέως χρησιμοποιούμενη μέθοδος για τον έλεγχο της παρουσίας προϊόντος PCR είναι η ηλεκτροφόρηση πηκτής αγαρόζης. Το οποίο χρησιμοποιείται για το διαχωρισμό θραυσμάτων DNA με βάση το μέγεθος και το φορτίο. Τα θραύσματα απεικονίζονται στη συνέχεια χρησιμοποιώντας βαφές ή ραδιοϊσότοπα.

Η εξέλιξη

Από την ανακάλυψη PCR, ανακαλύφθηκαν ϋΝΑ πολυμεράσες άλλες από την αρχική Taq. Ορισμένα από αυτά έχουν καλύτερη ικανότητα "διόρθωσης" ή είναι πιο σταθερά σε υψηλότερες θερμοκρασίες, βελτιώνοντας έτσι την εξειδίκευση της PCR και μειώνοντας τα λάθη από την εισαγωγή του λανθασμένου dNTP.

Ορισμένες παραλλαγές της PCR έχουν σχεδιαστεί για ειδικές εφαρμογές και χρησιμοποιούνται πλέον τακτικά σε μοριακά γενετικά εργαστήρια. Ορισμένες από αυτές είναι η PCR πραγματικού χρόνου και η αντίστροφη μεταγραφάση PCR. Η ανακάλυψη της PCR έχει επίσης οδηγήσει στην ανάπτυξη αλληλουχίας DNA, αποτύπωσης DNA και άλλων μοριακών τεχνικών.