Σημασία της συγκεκριμένης δραστηριότητας στην απομόνωση πρωτεϊνών

Η ειδική δραστηριότητα είναι ένας όρος που χρησιμοποιείται για τη μέτρηση του ρυθμού αντίδρασης ενός ενζύμου με ένα υπόστρωμα. Η ειδική δραστικότητα ενζύμου (ειδική δραστικότητα για βραχεία) είναι ένα μέτρο καθαρότητας ενζύμου και αναφέρεται ως μονάδες / mg . Η τιμή γίνεται μεγαλύτερη όταν ένα παρασκεύασμα ενζύμου καθίσταται καθαρότερο δεδομένου ότι η ποσότητα πρωτεΐνης (mg) είναι τυπικά μικρότερη, αλλά ο ρυθμός αντίδρασης παραμένει ο ίδιος (ή μπορεί να αυξηθεί λόγω μειωμένης παρεμβολής ή απομάκρυνσης αναστολέων).

Μετρά την κινητική του ενζύμου

Ως ένα κομμάτι του περιβάλλοντος, τα ένζυμα είναι πρωτεΐνες που δρουν ως καταλύτες στη μείωση της ποσότητας ενέργειας ενεργοποίησης για να συμβεί μια αντίδραση. Η ενέργεια ενεργοποίησης είναι η ενέργεια που απαιτείται για να ξεκινήσουν οι αντιδράσεις, επειδή πολλές αντιδράσεις δεν εμφανίζονται πολύ γρήγορα (ή καθόλου εμφανίζονται) εάν είναι θερμοδυναμικά δυνατές.

Τα ένζυμα καταλύουν συγκεκριμένες αντιδράσεις σε μια συγκεκριμένη τοποθεσία (γνωστή ως ενεργό σημείο) όπου τα αντιδραστήρια δεσμεύονται και αντιδρούν για να παράγουν τα προϊόντα. Τα υποστρώματα έχουν ενεργούς ιστότοπους που είναι ειδικοί μόνο για αυτούς, έτσι ώστε να μην δεσμεύονται ή να αντιδρούν άλλες ουσίες στην ίδια τοποθεσία. Όπως μια κλειδαριά και ένα κλειδί, κάθε ένζυμο θα καταλύει μόνο μία συγκεκριμένη αντίδραση (με μερικές εξαιρέσεις).

Ειδική δραστικότητα χρησιμοποιείται στις μεθόδους απομόνωσης πρωτεϊνών για την ένδειξη του ποσοστού καθαρισμού. Είναι σημαντικό να γνωρίζετε αυτή τη μονάδα όταν αγοράζετε ένζυμα για να υποδείξετε ακριβώς πόσο από το καθαρό ένζυμο παίρνετε.

Κατά την μέτρηση της κινητικής ενζύμου (ο ρυθμός αντίδρασης ενός ενζύμου με ένα υπόστρωμα ή επιφάνεια), η ειδική δραστικότητα ορίζεται ως η ποσότητα του υποστρώματος που μετατρέπει το ένζυμο (καταλυόμενες αντιδράσεις) ανά mg πρωτεΐνης στο παρασκεύασμα ενζύμου ανά μονάδα χρόνου.

Ένα παράδειγμα συγκεκριμένης δραστηριότητας θα είναι:

• Η ειδική δραστικότητα του απομονωθέντος ενζύμου μετρήθηκε σε 150 μιτιοΐβ / ιπϊη / ιη§ πρωτεΐνης πριν από τον καθαρισμό και 800 umoles / λεπτό / mg, μετά τον καθαρισμό.

Η συγκεκριμένη δραστηριότητα είναι ένα σημαντικό μέτρο της καθαρότητας του ενζύμου. Οι διαφορετικές παρτίδες ενός καθαρού ενζύμου πρέπει να έχουν τις ίδιες τιμές και ακόμη και η αραίωση ενός ενζυμικού διαλύματος πολλές φορές θα έχει ταυτόσημες τιμές ειδικής δραστικότητας, παρόλο που θα υπάρχουν διαφορετικές τιμές ενζυμικής δραστηριότητας. Αυτό συμβαίνει επειδή στον υπολογισμό της συγκεκριμένης δραστηριότητας ο αριθμητής (μονάδες / ml) και ο παρονομαστής (mg / ml) επηρεάζονται εξίσου.

Η συγκεκριμένη δραστηριότητα είναι πολύ διαφορετική από τη δραστηριότητα, αλλά ο υπολογισμός της συγκεκριμένης δραστηριότητας εξακολουθεί να εξαρτάται από την τιμή της δραστηριότητας. Αυτό σημαίνει ότι η αναφερόμενη συγκεκριμένη τιμή δραστηριότητας εξαρτάται επίσης από τον ορισμό της ενζυμικής μονάδας.

Οι παρτίδες ενζύμων που έχουν χαμηλότερη από την αναμενόμενη τιμή ειδικής δραστικότητας μπορεί να περιέχουν μόρια ενζύμων που έχουν μεταβληθεί ή αναμιχθεί με ακαθαρσίες.

Παράγοντες που επηρεάζουν τη δραστηριότητα του ενζύμου

Είναι πιθανό ότι ένα ένζυμο μπορεί να έχει διαφορετικές τιμές μετρημένης δραστηριότητας όταν μετριέται σε διαφορετικά εργαστήρια (δηλαδή, πραγματικές διαφορές στη μετρηθείσα δραστηριότητα, μη εμφανείς διαφορές που προκαλούνται από τη χρήση διαφορετικών ορισμών μονάδων).

Ο τρόπος διεξαγωγής μιας ανάλυσης (η μέθοδος ελέγχου για τον προσδιορισμό της καθαρότητας των ενζύμων) θα επηρεάσει τις αναφερόμενες τιμές δραστηριότητας. Για παράδειγμα, τα ένζυμα είναι γενικά πιο ενεργά μεταξύ των θερμοκρασιών των 37 βαθμών Κελσίου σε σύγκριση με τους 20 βαθμούς Κελσίου, οπότε εάν πραγματοποιηθεί ένας προσδιορισμός στους 21 βαθμούς Κελσίου, οι τιμές θα διαφέρουν από τις δοκιμασίες που διεξάγονται σε θερμοκρασία 32 βαθμών Κελσίου , οι δοκιμασίες διεξάγονται σε θερμοκρασία μεταξύ 20-37 βαθμών Κελσίου).

Έτσι, ο ορισμός της ενζυματικής μονάδας θα εκφράζεται καλύτερα ως 1 μονάδα (U) είναι η ποσότητα ενζύμου που καταλύει την αντίδραση 1 nmol υποστρώματος ανά λεπτό υπό κανονικές συνθήκες.