Τεχνικές για την αλληλουχία του DNA

Ο τομέας της βιοτεχνολογίας είναι ένας τομέας συνεχούς αλλαγής. Η ταχεία ανάπτυξη και ανάπτυξη της έρευνας αιχμής εξαρτάται από την καινοτομία και τη δημιουργικότητα των επιστημόνων και την ικανότητά τους να δουν το δυναμικό σε μια βασική μοριακή τεχνική και να την εφαρμόζουν σε νέες διαδικασίες. Η έλευση της PCR άνοιξε πολλές πόρτες στη γενετική έρευνα, συμπεριλαμβανομένου ενός μέσου ανάλυσης DNA και ταυτοποίησης διαφορετικών γονιδίων με βάση τις ακολουθίες DNA τους. Η ανάλυση αλληλουχίας του DNA εξαρτάται επίσης από την ικανότητά μας να χρησιμοποιούμε ηλεκτροφόρηση πηκτής για να διαχωρίσουμε κλώνους DNA που διαφέρουν σε μέγεθος από ένα μόνο ζεύγος βάσεων.

DNA Sequencing

Στα τέλη της δεκαετίας του '70, εφευρέθηκαν δύο τεχνικές προσδιορισμού αλληλουχίας DNA για μεγαλύτερα μόρια DNA: τη μέθοδο Sanger (ή διδεόξυ) και τη μέθοδο Maxam-Gilbert (χημική διάσπαση). Η μέθοδος Maxam-Gilbert βασίζεται στην ειδική διάσπαση νουκλεοτιδίων με χημικές ουσίες και χρησιμοποιείται καλύτερα για αλληλουχία ολιγονουκλεοτιδίων (μικρά νουκλεοτιδικά πολυμερή, συνήθως μικρότερα από 50 ζεύγη βάσεων σε μήκος). Η μέθοδος Sanger χρησιμοποιείται συνηθέστερα επειδή έχει αποδειχθεί ότι είναι τεχνικά πιο εύκολη η εφαρμογή της και με την έλευση της PCR και της αυτοματοποίησης της τεχνικής εφαρμόζεται εύκολα σε μακριές αλυσίδες DNA, συμπεριλαμβανομένων μερικών ολόκληρων γονιδίων.

Αυτή η τεχνική βασίζεται σε τερματισμό αλυσίδας με διδεοξυνουκλεοτίδια κατά τη διάρκεια αντιδράσεων επιμήκυνσης PCR.

Μέθοδος Sanger

Στη μέθοδο Sanger, ο κλώνος DNA που πρόκειται να αναλυθεί χρησιμοποιείται ως εκμαγείο και η DNA πολυμεράση χρησιμοποιείται, σε αντίδραση PCR, για την παραγωγή συμπληρωματικών κλώνων χρησιμοποιώντας εκκινητές. Κατασκευάζονται τέσσερα διαφορετικά μίγματα αντίδρασης PCR, που το καθένα περιέχει ένα ορισμένο ποσοστό αναλόγων διδεοξυνουκλεοσιδίου τριφωσφορικού (ddNTP) σε ένα από τα τέσσερα νουκλεοτίδια (ΑΤΡ, CTP, GTP ή ΤΤΡ).

Η σύνθεση του νέου κλώνου ϋΝΑ συνεχίζεται μέχρις ότου ενσωματωθεί ένα από αυτά τα ανάλογα, οπότε ο κλώνος είναι πρόωρα περικομμένος. Κάθε αντίδραση PCR θα καταλήξει να περιέχει ένα μείγμα διαφορετικών μηκών ϋΝΑ κλώνων, όλα τα οποία τελειώνουν με το νουκλεοτίδιο που είναι επισημασμένο διδεοξυ για αυτή την αντίδραση. Στη συνέχεια χρησιμοποιείται ηλεκτροφόρηση πηκτής για τον διαχωρισμό των κλώνων των τεσσάρων αντιδράσεων σε τέσσερις ξεχωριστές λωρίδες και προσδιορίζει την αλληλουχία του αρχικού προτύπου βασιζόμενη σε ποια μήκη των κλώνων τελειώνει με ποιο νουκλεοτίδιο.

Στην αυτοματοποιημένη αντίδραση Sanger, χρησιμοποιούνται εναρκτήρες που είναι επισημασμένοι με τέσσερις διαφορετικές έγχρωμες ετικέτες φθορισμού. Οι αντιδράσεις PCR, παρουσία των διαφορετικών διδεοξυνουκλεοτιδίων, εκτελούνται όπως περιγράφεται παραπάνω. Εν τούτοις, στη συνέχεια, τα τέσσερα μίγματα αντίδρασης στη συνέχεια συνδυάζονται και εφαρμόζονται σε μία λωρίδα μιας γέλης. Το χρώμα κάθε θραύσματος ανιχνεύεται χρησιμοποιώντας μία δέσμη λέιζερ και οι πληροφορίες συλλέγονται από έναν υπολογιστή ο οποίος παράγει χρωματογραφήματα που δείχνουν κορυφές για κάθε χρώμα, από τα οποία μπορεί να προσδιοριστεί η αλληλουχία ϋΝΑ εκμαγείου.

Τυπικά, η μέθοδος αυτοματοποιημένης αλληλούχησης είναι ακριβής μόνο για αλληλουχίες μέχρι το μέγιστο μήκος περίπου 700-800 ζευγών βάσεων. Ωστόσο, είναι δυνατό να αποκτηθούν πλήρεις αλληλουχίες μεγαλύτερων γονιδίων και, στην πραγματικότητα, ολόκληρα γονιδιώματα, με τη χρήση βηματικών μεθόδων όπως Primer Walking και Shotgun sequencing.

Στο Primer Walking, ένα επεξεργάσιμο τμήμα ενός μεγαλύτερου γονιδίου προσδιορίζεται ως προς την αλληλουχία χρησιμοποιώντας τη μέθοδο Sanger. Νέοι εκκινητές δημιουργούνται από ένα αξιόπιστο τμήμα της αλληλουχίας και χρησιμοποιούνται για να συνεχιστεί η αλληλουχία του τμήματος του γονιδίου που ήταν εκτός της εμβέλειας των αρχικών αντιδράσεων.

Η αλληλούχιση των κυνηγετικών όπλων συνεπάγεται την τυχαία κοπή του τμήματος ϋΝΑ ενδιαφέροντος σε περισσότερο κατάλληλα (διαχειρίσιμα) μεγέθους θραύσματα, την αλληλούχιση κάθε θραύσματος και την τακτοποίηση των τεμαχίων με βάση επικαλυπτόμενες αλληλουχίες.Αυτή η τεχνική έχει διευκολυνθεί από την εφαρμογή λογισμικού ηλεκτρονικών υπολογιστών για τη διευθέτηση των επικαλυπτόμενων τεμαχίων.