Τι απαιτείται για τα ανώτερα αποτελέσματα PCR

01 Καθαρές εργαστηριακές συνθήκες

Δεδομένου ότι η PCR είναι ικανή να ανιχνεύει ένα μόνο μόριο DNA, είναι σημαντικό να διατηρούνται οι παρθένες συνθήκες στο εργαστήριο. Να φοράτε πάντοτε φρέσκα γάντια. χρησιμοποιήστε αποστειρωμένα γυάλινα σκεύη, σωλήνες και άκρες πιπέτας. και καθαρίστε την περιοχή εργασίας πριν ξεκινήσετε την εργασία.

Συμπεριλάβετε πάντοτε αντιδράσεις ελέγχου, χωρίς DNA προτύπου και χωρίς ένζυμο, για να διασφαλίσετε ότι τα αποτελέσματα οφείλονται πραγματικά στην ενίσχυση του δεξιού δείγματος.

Οι περισσότεροι άνθρωποι φροντίζουν να έχουν τη δική τους σειρά λύσεων που δεν μοιράζονται για να διευκολύνουν την αντιμετώπιση προβλημάτων και οι καθορισμένες πιπέττες συχνά διατίθενται για PCR μόνο. Οι σωλήνες PCR χωρίς DNase και RNase, οι άκρες των πιπετών που είναι ανθεκτικοί στο αερόλυμα και η εργασία σε απορροφητήρα με υπεριώδη ακτινοβολία είναι επίσης τρόποι ελαχιστοποίησης των προβλημάτων.

02 Χημικά συστατικά

Επίσης, κρίσιμης σημασίας είναι η καθαρότητα και η ακεραιότητα του εκμαγείου (καθαρισμένο ϋΝΑ) και του σχεδιασμού του αρχικού τεμαχίου. Υπάρχουν διάφορα προγράμματα λογισμικού διαθέσιμα στο διαδίκτυο για το σχεδιασμό των εκκινητών. Τα καλύτερα αστάρια:

• Έχετε 18 έως 24 βάσεις
• Δεν έχουν δευτερεύουσα δομή (π.χ. βρόχους φουρκέτας)
• Έχουν ισορροπημένη κατανομή των ζευγών G / C και A / T
• Δεν είναι συμπληρωματικά μεταξύ τους στα άκρα των 3 ποδιών
• Έχουν θερμοκρασίες τήξης (Tm) περίπου 5-10 βαθμούς Κελσίου κάτω από τη θερμοκρασία ανόπτησης, η οποία είναι συνήθως μεταξύ 55 και 65 βαθμών Celcius. Το Tm και για τους δύο εκκινητές θα πρέπει επίσης να είναι παρόμοιο για καλύτερα αποτελέσματα.

03 Μείγμα αντίδρασης: Πρότυπο και Αστάρια

Οι αναλογίες του μίγματος αντίδρασης έχουν τεράστια επίδραση στην ποιότητα των αποτελεσμάτων PCR. Υπάρχει ένας γενικός τύπος για τις συγκεντρώσεις του εκμαγείου, του ενζύμου, των εκκινητών και των νουκλεοτιδίων για χρήση, αλλά αυτό μπορεί να τροποποιηθεί λίγο.

Οι βέλτιστες συγκεντρώσεις του εκκινητή είναι μεταξύ 0,1 και 0,6 μικρομορίων / L. Η ποσότητα του προτύπου ποικίλει ανάλογα με τον τύπο του DNA (ανθρώπινο, βακτηριακό, πλασμίδιο).

Με πολύ χαμηλά ποσά πρότυπου, υπάρχουν και άλλες στρατηγικές για τη βελτίωση των αποτελεσμάτων, όπως ο αυξημένος αριθμός κύκλων ή η χρήση της "θερμής εκκίνησης". Πάντα να δοκιμάζετε νέους εκκινητές με μια θετική αντίδραση ελέγχου, για να βεβαιωθείτε ότι λειτουργούν υπό τις συγκεκριμένες πειραματικές συνθήκες.

04 Μείγμα αντίδρασης: Ενζυμική δραστηριότητα

Η επιλογή της DNA πολυμεράσης επηρεάζει την πιστότητα της αντίδρασης και την ποιότητα του προϊόντος. Η παραδοσιακή πολυμεράση Taq έχει αντικατασταθεί σε πολλά εργαστήρια από υψηλότερα ένζυμα πιστότητας (εκείνα που κάνουν λιγότερα λάθη).

Η συγκέντρωση του MgCl2 στο μείγμα αντίδρασης μπορεί να επηρεάσει την έκβαση της PCR και θα μπορούσε να διαδραματίσει σημαντικό ρόλο σε πιο επιθετικές αντιδράσεις. Το κατιόν μαγνησίου σχηματίζει διαλυτά σύμπλοκα με dNTP για να παράγει το πραγματικό υπόστρωμα που αναγνωρίζει το ένζυμο πολυμεράσης.

Ίσες ποσότητες και των τεσσάρων dNTP συμβάλλουν επίσης στη μείωση του ποσοστού σφάλματος πολυμεράσης. Ορισμένα πρόσθετα όπως βηταΐνη, BSA, απορρυπαντικά, DMSO, γλυκερόλη και πυροφωσφατάση μπορούν επίσης να επηρεάσουν την εξειδίκευση του ενζύμου ή την αποτελεσματικότητα της αντίδρασης.

05 Τύπος θερμοκυκλώματος

Όταν αγοράζετε εργαστηριακό εξοπλισμό, λάβετε υπόψη ότι ορισμένοι θερμοκυκλοφορείς είναι λιγότερο ακριβείς από άλλους για τη διατήρηση των ακριβών, επιθυμητών θερμοκρασιών.

Αυτή είναι μια περιοχή στην οποία οι φτηνές δεν θα αποπληρώσουν μακροπρόθεσμα όταν αντιμετωπίζετε μια φαινομενική αντίδραση ή χρησιμοποιώντας αστάρια που απαιτούν ένα στενό εύρος θερμοκρασίας ανόπτησης.

Οι σωλήνες αντίδρασης με λεπτό τοίχωμα που έχουν σχεδιαστεί για να ταιριάζουν στην ακριβή μάρκα θερμοκυκλοφορίας που χρησιμοποιείτε βοηθούν επίσης στη βελτιστοποίηση των θερμοκρασιών αντίδρασης.

06 Ρυθμίσεις κύκλου

Τα μήκη κύκλου αντίδρασης, οι θερμοκρασίες και ένας αριθμός κύκλων, έχουν όλα καθοριστικό ρόλο στον καθορισμό του βαθμού στον οποίο θα λειτουργήσει μια PCR. Το βήμα αρχικής θέρμανσης πρέπει να είναι αρκετά μεγάλο ώστε να αποδιαμορφώνει πλήρως το πρότυπο και οι κύκλοι πρέπει να είναι αρκετά μακρύς ώστε να εμποδίζεται η τήξη του λιωμένου DNA από τον εαυτό του.

Η αυξημένη απόδοση μπορεί να επιτευχθεί με την αύξηση του χρόνου επέκτασης σε κάθε 20 κύκλους, για να αντισταθμιστεί το μικρότερο ένζυμο για να ενισχυθεί περισσότερο το πρότυπο. Συνήθως, λιγότεροι από 40 κύκλοι είναι αρκετοί για να ενισχύσουν λιγότερα από 10 μόρια προτύπου σε μια συγκέντρωση αρκετά μεγάλη ώστε να βλέπουν σε μία πηκτή αγαρόζης βαμμένη με βρωμιούχο αιθίδιο.